Как определяется распределение молекулярной массы (ГПХ против ТСА-N)?

За пределами биофармацевтики | Часто задаваемые вопросы о растительных белковых пептидах

Краткий ответ:ГПХ, также называемая гель-хроматографией, разделяет пептиды по размеру и отображает полное распределение молекулярной массы с пиком и диапазоном, в то время как индекс растворимости в ТСА является упрощенным индикатором, основанным на растворимости, показывающим, насколько белок расщеплен на мелкие фрагменты. Эти два теста отвечают на разные вопросы, основаны на разных физических принципах, и их результаты не являются напрямую сопоставимыми.

Что именно измеряют GPC или SEC

Гель-проникающая хроматография, также называемая эксклюзионной хроматографией, пропускает разбавленный раствор пептида через колонку, заполненную пористыми шариками. Крупные молекулы не могут проникнуть в большинство пор и быстро перемещаются по колонке, в то время как мелкие молекулы исследуют поры и элюируются позже. Детектор регистрирует количество элюируемого вещества в каждое время удерживания, а калибровка с использованием стандартов с известной молекулярной массой преобразует время удерживания в кажущуюся молекулярную массу. В результате получается кривая распределения, а не одно число, что является ее главным преимуществом: она показывает, преобладают ли в веществе короткие пептиды или же в нем все еще присутствует хвост из длинных цепей.

Как читается отчет GPC

• Диапазон молекулярной массы- диапазон от самых маленьких до самых крупных видов, присутствующих в значительных количествах.
• Пиковая молекулярная масса- размер верхней границы распределения, описывающий доминирующую популяцию.
• Доля ниже порогового значения- например, процент распределения ниже заявленной молекулярной массы, показатель, наиболее часто используемый в торговых спецификациях.
• Полидисперсность- отношение средневесовой молекулярной массы к среднечисловой молекулярной массе, простой показатель того, насколько широко распределение.

Поскольку ГПХ — это относительный метод, на результат влияют калибровочный стандарт, колонка, подвижная фаза и детектор, поэтому кажущуюся молекулярную массу всегда следует определять вместе с указанным методом.

Что измеряет индекс растворимого азота ТСА?

Трихлоруксусная кислота осаждает крупные неповрежденные белки, оставляя более мелкие фрагменты в растворе. После осаждения и центрифугирования измеряют содержание азота в растворимой фракции, обычно методом Кьельдаля, и выражают его в процентах от общего содержания азота. Высокое значение указывает на то, что большая часть азота находится в небольших, кислоторастворимых фрагментах, что на практике означает, что вещество подверглось интенсивному гидролизу. Это быстрый и недорогой показатель степени гидролиза, который часто используется в качестве упрощенного индикатора растворимости. Однако он не дает распределения: он сообщает только одно агрегатное число и не может сказать, состоит ли растворимая фракция из дипептидов или из средних цепей.

Почему эти два явления нельзя напрямую сравнивать

Таким образом, эти два метода не являются напрямую сопоставимыми. Показатель растворимости азота в ТСА нельзя преобразовать в диапазон молекулярной массы, а распределение, полученное методом ГПХ, не позволяет предсказать число ТСА, поскольку один метод представляет собой химическое фракционирование, а другой — физическое разделение по размеру, причем каждый из них зависит от своих условий. Если в спецификации требуются оба метода, они должны быть указаны в сертификате как отдельные параметры со своими методами и ограничениями.

Как их использовать вместе

ГПХ используется в качестве эталона, когда речь идет о характеристиках популяции пептидов, например, при проверке соответствия сорта целевому профилю. Индекс растворимости в ТСА (трихлорацетаминовой кислоте) эффективен для рутинного контроля партий, поскольку он быстр и дешев, а также хорошо отслеживает степень гидролиза при стабильном процессе. Распространенный подход заключается в установлении профиля ГПХ для соответствующего сорта, затем в контроле производства с помощью более простого индекса и периодическом подтверждении профиля или после изменения процесса.

Рекомендуемая литература

Для получения более подробной информации см.как измеряется и определяется горечь,Растворимость в холодной воде и прозрачность раствораиПочему коэффициенты пересчета азота различаются в зависимости от источника.